番石榴叶黄酮提取物(响应面法优化沙枣叶黄酮提取工艺研究)
沙枣，又名香柳，香柳，银柳，七里香，等。是胡桃科的一种落叶小乔木或灌木，主要分布在中国各省西北部。干燥后，将沙枣树叶粉碎，用水提取。对肺炎有很好的疗效；沙枣叶含有苷类、生物碱、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等物质，具有抗心律失常、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗病毒和增强免疫力的作用。
黄酮类化合物是广泛分布于植物界的多酚类化合物，具有多种生物活性。作为自由基清除剂，沙枣是理想的天然抗氧化剂之一。李红等人[5]报道了从沙枣，提取的对，类黄酮具有很强的清除自由基的能力。本文以沙枣叶总黄酮为研究对象，以水为提取溶剂，对对象进行了研究。在单因素试验的基础上，采用响应面法对沙枣树叶中黄酮类化合物的提取条件进行了分析和优化。1仪器和材料
1.1仪器722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；恒温水浴锅。1.2材料芦丁对(批号：100080-200707，药学，论文生物制品检定所)；沙枣(采自石河子市， 新疆)被鉴定为胡颓子；新疆； 石河子大学药学学院的谭勇教授说，所有使用的试剂都是分析纯的。
2方法2.1芦丁标准工作曲线的建立以芦丁为标准品分光光度法测定沙枣黄酮类化合物[5-9]。准确称取10.0毫克在120干燥至恒重的芦丁对样品，放入10毫升容量瓶中，加入适量70%乙醇使其完全溶解，用乙醇稀释至刻度，摇匀，所得溶液含1毫克/毫升芦丁对样品。准确吸收0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0毫升1.0毫克/毫升芦丁对样品溶液，放入25毫升容量瓶，依次加入0.3毫升5%二氧化硅溶液，摇匀，放置6分钟，然后加入0.3毫升10%三氧化二铝溶液，摇匀加入4.0毫升4%氢氧化钠溶液，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15分钟，然后线性回归方程为Y=0.0948x-0.0523，r=0.9991，以吸光度为纵坐标，以对样品溶液的浓度(毫克/毫升)为横坐标。
2.2总黄酮含量的测定取5ml待测提取物，放入25ml容量瓶中。参照上述方法测定吸光度，根据芦丁标准溶液浓度(c)和吸光度(a)的回归方程计算芦丁含量。总黄酮提取率的公式为：总黄酮提取率(%)=(提取液浓度体积稀释倍数/原料质量)100%。2.3提取工艺优化实验通过设定不同的液料比、提取时间、提取温度和酸碱度，观察不同单因素对对提取率的影响。在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验的设计原则，以A (料液比)、B(提取时间)、C(提取温度)和D(酸碱度)为自变量，总黄酮得率(%)为响应值，设计了四因素三水平的响应面分析试验。利用Design-Expert8.0软件对实验数据进行分析，得到响应面分析图和方差分析表。测试因素和水平见表1。
3结果与分析3.1提取条件对对总黄酮提取的影响
3.1.1液料比对对，提取效果的影响称取4份1g干沙枣叶粉，放入100毫升锥形瓶中。在提取液为蒸馏水、提取时间为4h、温度为室温、提取时间为2次的条件下，分别加入10、15、20、25倍量的水提取总黄酮。根据标准曲线的制作方法，考察了液固比对对沙枣树叶中黄酮类化合物提取的影响。沙枣叶总黄酮得率分别为0.12%、0.39%、0.38%和0.36%，料液比叶总黄酮得率为115。3.1.2提取时间对对提取效果的影响称取4份1g干燥的沙枣叶粉，分别置于100毫升锥形瓶中。在提取液为蒸馏水、料液比比为115、温度为室温、提取时间为4、6、8和10小时的条件下，采用标准曲线法考察了提取时间对对沙枣叶黄酮提取效果的影响。总黄酮得率分别为2.34%、3.69%、4.01%和3.98%。当提取时间为8h时，提取效果最佳。
3.1.3提取温度对对，提取效果的影响称取4份1g干沙枣叶粉，分别置于100毫升锥形瓶中。在提取液为蒸馏水、料液比比为1: 15、提取时间为6h、提取时间为1次、提取温度分别为20、40、60和80的条件下，采用标准曲线法研究了提取温度对对沙枣叶黄酮提取的影响。不同温度下的提取率分别为3.36%、3.40%、3.82%和3.59%，提取温度达到60时提取效果最佳。3.1.4酸碱度对对萃取的影响称取4份干燥的沙枣叶粉末，分别放入100毫升锥形瓶中。在提取液为蒸馏水、料液比比为1: 15、提取时间为6h、提取温度为60、提取次数为1次的条件下，设定pH6、8、10，按照标准曲线的制作方法，研究了pH6对对沙枣叶黄酮提取的影响。提取率分别为0.27%、0.32%、0.38%和0.37%。从结果可以看出，随着酸碱度的增加，对提取的效果逐渐增强，当酸碱度超过8时，提取效果最好。
3.2响应面法优化沙枣树叶中黄酮类化合物的提取工艺响应面法共有29个测试点，设计及结果见表2。采用响应面分析法对实验结果进行分析，得到以总黄酮得率为响应值的回归方程为：总黄酮得率=6.470.45 a 0.11 b 0.044 c 0.063d-0.088 a B- 0.25 AC 0.035 ad-0.045 BC 0.022 BD-0.048 CD-1.17 a2-0.45 B2-0.0。从表3可以看出，当黄酮得率作为响应值时，模型P0.0001表明二次方程模型具有很高的显著性，可用于指导沙枣叶总黄酮提取的实验设计。影响对黄酮类化合物提取量的各种因素是料液比提取时间、酸碱度和提取温度，黄酮类化合物提取率的97.58%的变化来自所选变量的变化。从表3可以看出，一次项A、交互项AC和二次项A2、B2、C2和D2都有极显著性差异(P 0.01)。失配项P0.05表明拟合度较好，未知因子对对实验结果干扰较小。响应面分析法的图形是由各种因素组成的三维空间，具体的响应值对，直接反映了各种因素对对响应值的影响。它们之间的相互作用可以从实验响应面分析图[10]中进行分析，各种因素之间相互作用的响应面图如图2所示。
从图2可以看出，当料液比较小时，提取时间、提取温度和酸碱度增加，曲面向下弯曲，表明料液比和三者之间的相互作用抑制了总黄酮的浸出。从等高线可以分析出，料液比的等高线在小时排列紧密。后三者和对对总黄酮的提取影响较大。随着这三者的增加，产量呈上升趋势，但达到一定程度后开始下降。同样，也可以通过分析其他因素来了解相互作用。3.3验证试验通过Design-Expert 8.0软件分析，沙枣叶总黄酮提取的最佳条件为：料液比为115.96，提取时间为8.20小时，提取温度为59.73，酸碱度为8.15，总黄酮得率为6.51%。考虑到可操作性，优化工艺参数的条件为：料液比比为116，提取时间为8.00小时，提取温度为60，pH值为8。根据修改后的工艺参数，进行了验证试验。结果表明，总黄酮得率为6.49%，相对与预测值的偏差为0.46%，表明工艺参数准确可靠。
结论在单因素试验的基础上，选择料液比、提取时间、提取温度和提取酸碱度为因素，采用响应面法优化提取条件，以总黄酮得率为响应值。结果表明，用Box-Behnken法建立的沙枣叶总黄酮提取工艺模型具有较高的提取率，能够很好地预测实验结果。
黑曼巴 