氯氰菊酯对人的毒性(氯氰菊酯中毒)

本文是一篇关于氯氰菊酯、转录因子和核转录因子的小论文。

、陈冲、王力、吴学森

[文摘]

目的:研究氯氰菊酯对小鼠小脑组织氧化损伤和核转录因子E2相关因子2基因表达的影响。

方法:将40只昆明种小鼠随机分为4组，其中阴性对照组1只，氯氰菊酯暴露组3只。暴露组口服5、10、20毫克/千克剂量，持续3周。用小脑匀浆法测定丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的含量。免疫组织化学法检测小脑组织细胞中Nrf2的表达。用反转录聚合酶链反应检测Nrf2基因的表达。

结果:随着氯氰菊酯暴露剂量的增加，小脑组织丙二醛含量逐渐增加，谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等酶活性逐渐升高。逐渐减少。暴露组与对照组之间的差异有统计学意义(P0.01)。免疫组织化学显示，随着照射剂量的增加，小脑组织核内的Nrf2阳性细胞表达增加，差异有统计学意义(P0.01)。高剂量暴露组核阳性细胞的表达高于低剂量暴露组(P0.01)。逆转录聚合酶链反应显示，随着照射剂量的增加，Nrf2带的光密度增加，与对照组相比有统计学意义(P0.01)。高剂量暴露组的基因表达高于低剂量暴露组(P0.01)。

结论:CYP暴露可导致小鼠小脑组织氧化损伤，并导致氧化应激反应中的关键分子Nrf2从细胞质向细胞核移位，从而增强脑组织抵抗氧化应激的能力。

[关键词]氯氰菊酯；氧化损伤；核转录因子E2相关因子2；老鼠

[中国图书馆分类号] R595.4

[文号代码]adoi 333610 . 13898/j . CNKI . ISSN . 10002200 . 2016 . 07 . 002

氯氰菊酯，CYP)是一种二型拟除虫菊酯类农药。长期低剂量接触这类杀虫剂会导致神经系统紊乱、葡萄糖代谢紊乱，甚至癌症[1-2]。脑组织是氧化代谢最活跃的器官，含有高浓度的多不饱和脂肪酸，对脂质过氧化高度敏感，其抗氧化能力低于其他主要器官。CYP可以穿过血脑屏障，选择性地作用于脑组织，在该部位诱导氧化应激，从而导致神经元损伤、变性、凋亡或坏死[3-5]。核转录因子E2相关因子2(核因子红系2相关因子2，Nrf2)是氧化应激反应中的关键因子。在生理状态下，Nrf2与细胞质蛋白伴侣Keap1结合。Nrf2的功能处于抑制状态。当受到内部和外部自由基和化学物质的刺激时，Nrf2从Keap1解离并被激活。活化的NRF2从细胞质进入细胞核，并与抗氧化反应元件相互作用。同时结合和激活下游抗氧化酶和第二阶段解毒酶的表达，如1(血红素加氧酶1，血红素氧合酶1)，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，过氧化氢酶)和其他抗氧化和解毒酶，从而保护身体免受相关物质[6-8的入侵。与大脑相比，小脑不饱和脂肪酸含量更高，更容易受到自由基的影响。本研究旨在通过体内实验观察不同剂量CYP暴露对小鼠小脑组织氧化应激和Nrf2基因表达的影响，探讨CYP的神经毒性机制，为合理选择农药提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验动物和材料

1.1.1实验动物及组40只健康成年雄性昆明小鼠[证号:(安徽)]，由安徽医科大学实验动物中心提供，体质量(30.59磅；2.64) g .动物饲养温度(24分；2)℃，相对湿度(50plun10)%，给小鼠喂食商业鼠食，在实验期间小鼠可以自由进食和饮水。将40只昆明种小鼠随机分为4组，其中阴性对照组1只，氯氰菊酯暴露组3只，每组10只。参考[9]，暴露组的剂量被确定为5、10和20 mg/kg，并且小鼠被连续口服给药3周。m的体重

1.1.2主要试剂和仪器:氯氰菊酯标准品(西格玛公司，纯度99%)、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶)、过氧化氢酶和总蛋白定量测定试剂盒(南京程健生物工程研究所)、兔抗鼠多克隆抗体二代(安博博公司)、核糖核酸提取试剂(北京天根生化科技有限公司)、逆转录酶和聚合酶链反应试剂盒(发酵罐公司)。低温离心机(德国埃彭多夫公司)、生物倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、Synergy2酶阅读器(美国毕奥泰克公司)、聚合酶链反应梯度扩增仪(东升龙公司)。

1.2实验方法

1.2.1实验过程中的一般观察，观察各组小鼠的表情、进食量和活动情况，每天称体重，分析体重变化。

1.2.2检测抗氧化和抗氧化指标，制备组织匀浆。按照试剂盒说明书检测丙二醛含量和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性。组织匀浆的蛋白质含量由总蛋白定量试验箱测定。

1.2.3免疫组织化学方法用于检测Nrf2阳性细胞的表达。多聚甲醛固定于小脑组织24小时。常规石蜡包埋，连续切片。截面厚度约为4微米，每5个拍摄一次。从每个样本中选择10个样本。采用免疫组织化学方法检测Nrf2蛋白在小脑组织中的表达。具体操作按照试剂盒的说明进行。细胞质或细胞核被棕色颗粒染色为Nrf2阳性细胞。从每个部分随机选择五个高功率场，并在对阳性细胞计数后取平均值。

1 . 2 . 4逆转录聚合酶链反应分析基因表达采用核糖核酸提取试剂盒分组提取总核糖核酸，取光密度值为1.8-2.0的核糖核酸进行反转录，按照试剂盒程序进行反转录步骤，每组取2 μ L的cDNA进行聚合酶链反应，反应体系为50μL。(1)NRF 2扩增片段215 bp；引物序列正义5 ' ttctctcttgctgcat tagtcagtcagc5 '，反义5 ' gccttctcatctttcggagcactg3扩增条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，57.9℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。(2)扩增150 bp2)β-肌动蛋白片段；引物序列有义5' agtgtg acgtg acatccgta3 '，反义5 ' gccagcaga gcaga gtattccttt3扩增条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。用凝胶成像系统对聚合酶链反应产物进行凝胶电泳和条带光密度半定量分析。

1.3统计方法是方差分析和Q检验。

结果

2.1一般来说，观察到对照组的小鼠具有正常的食物摄入、平静的表情和有光泽的毛发颜色。暴露组小鼠精神状态差，毛发颜色深，耳朵、尾巴和爪子有不同程度的咬痕，高剂量组尤为明显。暴露前各组小鼠体重无显著差异(P0.05)。与暴露前相比，暴露后各组小鼠的体重增加(P0.01)，各组小鼠的体重增加程度无显著差异(P0.05)(见表1)。

2.2与小鼠小脑组织中TSOD、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛的含量相比，暴露组小鼠小脑组织中丙二醛的含量显著高于对照组(P0.01)，而三组CYP暴露小鼠小脑组织中丙二醛的含量具有统计学意义(P0.01)。随着暴露剂量的增加，小鼠小脑组织中TSOD、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性逐渐降低，各暴露组与对照组的差异有统计学意义(P0.01)(见表2)。

与2.34组小鼠小脑组织中Nrf2阳性细胞的表达相比，Nrf2蛋白集中在小脑组织的细胞质中，细胞核的表达较弱。CYP照射后，核内Nrf2阳性细胞的比例逐渐增加，细胞质的表达逐渐减少(见图1)。cyp 10 mg/kg组和20 mg/kg组细胞浆中Nrf2阳性细胞的表达低于对照组(P0.05 ~ P0.01)。然而，在CYP 20毫克/千克组中，胞质Nrf2阳性细胞的表达低于CYP 5毫克/千克和10毫克/千克组(P 0.05)。核的表达

与对照组相比，暴露后2.44组小鼠小脑组织中Nrf2基因表达无显著性差异(P0.05)。CYP 10毫克/千克组和20毫克/千克组的条带比对照组更清晰(见图2)。两组的核转录因子2基因表达均显著高于对照组(P0.01)。同时，CYP 10和20毫克/千克组的波段光密度值显著高于CYP 5毫克/千克组(P0.01)(见表4)。

3讨论

随着CYP应用面积的增加，其毒性逐渐受到重视。氧化应激是CYP公认的毒性机制，并且在缺乏外源性抗氧化剂如维生素C和维生素E的情况下，Nrf2可以诱导基因抵抗氧化应激，激活身体自身的保护性反应，甚至防止各种氧化应激相关并发症。Nrf2通过与ARE相互作用调节抗氧化蛋白的编码，激活第二阶段解毒酶和抗氧化酶基因的表达，并且保护细胞组织的正常功能[10-12】。

本研究证实，CYP使小脑组织产生更多的脂质过氧化产物，降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等酶活性。最终导致抗氧化能力下降，并且随着暴露剂量的增加对酶活性的影响越大。免疫组织化学显示，染毒组细胞核内Nrf2阳性细胞的表达高于对照组，同时阳性细胞的表达与染毒剂量有关。高剂量暴露组的Nrf2阳性细胞表达高于低剂量暴露组。逆转录聚合酶链反应显示，接触组的核转录因子2基因的表达高于对照组。中剂量和高剂量暴露组中NRF2基因的表达与对照组有显著差异。同时，中剂量、高剂量照射组与低剂量照射组之间的差异也有统计学意义(P0.05 ~ P0.01)。显然，CYP对小鼠小脑组织的损伤具有剂量-效应关系。CYP暴露导致抗氧化应激能力下降。当身体产生氧化应激时，内源性抗氧化系统被激活，导致Nrf2和Keap1的解离。Nrf2从细胞质转移到细胞核，诱导下游抗氧化靶基因的表达，从而增强脑组织的抗氧化能力。文学[13-17]报道。溴氰菊酯可影响Nrf2/ARE转导通路，提高Nrf2基因及其下游基因GCS的转录水平。七氟醚通过激活Nrf2信号通路诱导大鼠海马神经元HO-1基因表达。可以看出下游基因表达的增强是由激活的Nrf2介导的，其通过抗氧化损伤进一步发挥神经保护作用。

CYP暴露可降低身体的抗氧化能力，诱发小脑组织的氧化损伤，引起氧化促进系统和抗氧化系统之间的失衡，激活Nrf2，并将Nrf2从细胞质转移至细胞核，从而增强脑组织抵抗氧化应激的能力。抗氧化剂可能具有预防和治疗CYP中毒的作用，而增强抗氧化酶的活性可能是预防和治疗CYP中毒的有效方法。

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