自发乳腺癌小鼠(乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织VEGF及MVD表达影响的研究)

观察乳宁合剂对小鼠乳腺癌组织中血管内皮生长因子表达和微血管密度的影响。方法建立小鼠乳腺癌移植模型，分为乳腺癌模型组、参一胶囊组、乳宁合剂高剂量组、中组和低剂量组。各组给药后21天，用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中血管内皮生长因子和微血管密度。结果与模型组相比，乳宁合剂高剂量组、中-dose高剂量组和参一胶囊组血管内皮生长因子和微血管密度均显著降低(P0.05)，其中中在参一胶囊组最为明显，其次是乳宁合剂高剂量组和中-dose高剂量组，且呈量效关系。结论乳宁合剂可能通过抑制肿瘤血管生成发挥抗肿瘤作用。关键词：乳宁合剂；乳腺癌；血管内皮生长因子；三阴性乳腺癌(TNBC)是一种具有特殊生物学行为和临床病理特征的独立型乳腺癌，在中，占乳腺癌总发病率的10 ~ 20.8%。现有研究表明，与非TNBC相比，TNBC具有高侵袭性、术后复发和转移风险高、疾病进展快和内脏转移风险高的特点[2]。目前，对的TNBC尚无明确的治疗标准，我国五常老中医学专家学术经验传承的第四任、第一任导师李斯文，教授和云南省，著名的中医生在中，乳宁合剂，等地倡导以补肾活血方为主的三阴乳腺癌治疗中从肾论治，就是为此而设立的。本实验建立小鼠三阴性乳腺癌模型，用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中中血管内皮生长因子和微血管密度的表达，探讨乳宁合剂材料1.1实验动物和细胞系4 ~ 6周龄雌性BALB/c(nu/nu)小鼠抗三阴性乳腺癌的作用机制，SPF级，体重182g，购自北京维通利华实验动物有限公司，证号scxk(京)2007-0001。中辛，中国科学院昆明动物研究所饲养的实验动物。人TNBC细胞系MDA-MB-231购自中国科学院昆明动物研究所培养的中心脏。1.2 中药乳宁合剂主要由熟地黄、淫羊藿、菟丝子、枸杞子、丹参、郁金、莪术、木通、薏苡仁、当归组成。以上中药品由云南省， 中医学院中药房提供，由我院制剂室配制。制备方法：将中药物浸泡2小时，煎煮3次，合并3次滤液，4冰箱保存。参一胶囊(吉林亚泰制药有限公司，批号：20140910)。1.3试剂ZLI-9032浓缩DAB试剂盒和兔抗小鼠CD34单克隆抗体由中， 北京， 杉金桥生物技术有限公司生产，批号60882801。1.4仪表电子天平js 1603-c:瑞士；斯特普20除湿器公司的迈特勒公司：微波公司；Af280-2包埋机：微波公司；HM335E切片机：微电机公司；尼康e.elipse 80i显微镜：尼康公司；卡尔蔡司智能系统公司：卡尔蔡司公司；DRP-9052电热培养箱：上海森信实验仪器有限公司；BG-270防水电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂2.1方法2.1对生长期乳腺癌小鼠模型TNBC MDA-MB-231细胞的制备、分组和给药将细胞接种于BALB/C雌性小鼠的左腋皮下，细胞密度调整为1107细胞/毫升，当小鼠皮下实体瘤生长至直径5毫米时，随机分组给药。

参一胶囊组用生理盐水制成5 mg/kg混悬液；分别在乳宁合剂，的高、中和低剂量组用生理盐水制备32克/千克、16克/千克、8克/千克。上述各组每天给每只动物注射10毫升/千克。乳腺癌模型组每天给予等量的生理盐水。上述各组连续给药3周。2.2观察指标的测量2.2.1肿瘤重量和肿瘤抑制率的检测连续灌胃21天后，第二天处死小鼠，剥离肿瘤体。用电子天平称量各组小鼠实体瘤重量，计算抑瘤率()[3]:=对组-治疗组)/对组100%。2.2.2小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子表达的测定肿瘤切除后，用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，在肿瘤最大处连续切片3 ~ 5um，并进行免疫组织化学染色。将切片在60烘箱中烘烤2小时；将切片脱蜡至水；用蒸馏水洗涤2分钟；高压热修复：将适量自来水放入高压锅，将修复液倒入烧杯中，在高压锅中煮沸烧杯，将切片放入装有修复液的烧杯中，加热至设定压力，然后排气2分钟，然后用自来水冷却；3%H2O2溶液阻断过氧化物酶10分钟；用PBS洗涤5分钟3次；滴加一级抗体，37孵育60分钟；用PBS洗涤5分钟3次；滴加第二抗体，37孵育60分钟；用PBS洗涤5分钟3次；由DAB进行颜色显影；再染色、透明密封和显微镜观察。2.2.3小鼠肿瘤组织微血管密度的计算用血管内皮生长因子免疫组织化学方法染色后，首先在低倍镜(100)下观察切片，确定肿瘤内的最高血管密度，高血管密度区大多位于肿瘤边缘。在高倍镜(400)下，肿瘤中任何棕色染色的内皮细胞或细胞簇都被视为血管，只要其分支结构不相连，就被视为血管。记录5个视野中的微血管数，取平均值作为切片的微血管密度值。2.3统计方法：测量数据用平均标准差(x s)表示，统计数据用SPSSl3.0统计软件包获得，用方差分析进行多组间比较，然后用LSD法进行组间成对比较，P0.05有统计学意义。结果3.1 乳宁合剂对小鼠移植瘤的抗肿瘤作用见表1。3.2 乳宁合剂对，荷瘤小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子和微血管密度的作用见表2。从表2可以看出，乳宁合剂各剂量组和沈懿胶囊组的血管内皮生长因子和微血管密度的表达均低于模型组，乳宁合剂， 中高剂量组和中剂量组的血管内皮生长因子和微血管密度与模型组相比有统计学意义(P0.05)。提示对， 乳宁合剂乳腺癌移植瘤中血管内皮生长因子和微血管密度的表达受到抑制，尤其是高剂量组。