沙棘总黄酮(沙棘叶总黄酮的提取工艺优化)
沙棘属于胡颓子科，沙棘属，又名醋柳，被国际医学科学家和营养学家誉为21世纪最有前途的药用和营养保健植物。沙棘采集于1977年《中华人民共和国药典》。内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实品质高的特点。沙棘作为防护林发挥着巨大的作用，其种植面积逐年增加。研究叶黄酮沙棘的提取工艺，旨在筛选出适合叶黄酮，沙棘的提取工艺，获得高含量的总黄酮，促进沙棘资源的综合利用。
1仪器和试剂1.1仪器722可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；DZKW-S-8电热恒温水浴箱(北京市永光明医疗器械厂)；RE-52旋转式真空蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D()循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；101-2型数显电热鼓风恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。
1.2材料叶沙棘采自内蒙古， 乌兰察布市(集宁区)，经杨鸿飞教授鉴定为叶沙棘，经充分粉碎，过35目筛，置于干燥器中备用。芦丁对(批号：100080-201407，中国药品生物制品检定所)。其他试剂是分析纯的。2方法和结果
2.1 叶沙棘中总黄酮含量的测定2.1.1标准曲线的制备准确称取120干燥至恒重的20毫克芦丁标准品，溶于70%乙醇中，定为100毫升，使其浓度为200微克/毫升。分别取10、15、20、25、30、35、40和45毫升，用70%乙醇定容50毫升，得到40、60、80、100、120、140、160和180微克/毫升的芦丁溶液。在试管中各加入1毫升，加入1毫升70%乙醇，加入0.5毫升5% NaNO2，混合均匀，放置6分钟；然后加入0.5毫升10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6分钟；最后加入6毫升4%的氢氧化钠，放置15分钟，在510纳米(亚硝酸钠-硝酸铝比色法)测定不同浓度标准的吸光度值。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。回归方程为Y=477.38-2.261(R=0.9979)。结果表明，芦丁在0120g/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
2.1.2样品中黄酮含量的测定取一定量的叶黄酮沙棘样品，配制样品溶液。然后取一定量的总黄酮样品溶液，并将体积固定到一定体积。在试管中各取1毫升，用“2.1.1”比色法测量吸光度值，计算总黄酮含量。X=YVn100%/m .
在公式中，x是样品中的总黄酮含量，y是样品溶液中的总黄酮浓度(毫克/毫升)，可通过回归方程计算。v是样品溶液的体积(毫升)；n是稀释倍数；m是样品量(mg)[7]。2.2提取条件的优化
2.2.1提取溶剂的选择：取6月份粉碎的叶沙棘8片，每片1g，加入10毫升甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇，在70水浴中加热提取10分钟，过滤。用70%乙醇调至50毫升，在试管中各取1毫升，用第2.1.1项中的比色法测定吸收值，并计算提取率。用同样的方法进行了三个平行实验，以确定最佳提取溶剂。结果如图1所示。从图1可以看出，沙棘全黄酮在甲醇、乙醇和水等极性溶剂中溶解度高，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂中，溶解度小，提取率低。在测试的溶剂中，甲醇是最好的，但它有毒，给操作带来不便。由于乙醇具有无异味、无残留、安全性好、易回收等优点，所以选择乙醇作为提取溶剂。
2.2.2提取原料的选择：5月至9月取5份沙棘粉碎样品，每份10克，加入150毫升50%乙醇，在70水浴中加热提取30分钟，过滤，蒸发乙醇，用50%乙醇调节体积至100毫升，用50毫升容量瓶中稀释5毫升至50毫升，在试管中取1毫升，测定吸收值，计算总黄酮黄酮化合物是植物生理过程中的次生代谢产物，在植物发育阶段常受酶的调节和遗传机制的控制。黄酮化合物的含量在不同的发育阶段是不同的。从图2可以看出，5月份日照时间长，植物处于旺盛生长期，因此5月份黄酮含量高；随后，植物的生长变慢，合成量减少，或者转化被其他物质取代，所以含量降低。然而，西北地区5月份，叶种子处于萌发期，产量较低，不适宜选择。7月，叶有所成长，也有所失败，黄酮内容的高峰又出现了。7月份的叶不宜作为实验原料。
2.2.3多因素正交试验在单因素筛选的基础上，设计了多因素试验表，如表1所示。取7月份叶粉碎样品1克，按以下正交试验条件提取过滤，用70%乙醇调至30毫升。在试管中各取1毫升，测量吸光度，计算总黄酮含量，并确定最佳提取条件。多因素正交试验结果见表1。直观分析表明，从叶提取总黄酮的影响因素顺序为CBAD，即提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间，优化组合后提取因素的选择为A2B2C3D1。方差分析结果见表2，所有影响沙棘总黄酮提取的因素均为极显著因素(P0.01)。综合考虑，最佳提取条件为A2B2C3D1，即以叶7月份为例，以60%乙醇为溶剂，料液比为120，在80提取30分钟，提取效果较好。
2.3测定沙棘总黄酮的产量和含量，准确称取7月份叶粉碎的沙棘100克，按照上述确定的最佳提取条件提取，提取液在60减压浓缩回收乙醇，浓缩液在60烘箱中干燥，称量干燥后的粗品质量，得到黄酮粗品的产量。1g溶于70%乙醇溶液中，稀释一定倍数，取1ml测定粗品的总黄酮含量。结果如表3所示。从表4可以看出，在这种提取条件下，从100克叶压碎样品中可以获得8.71克粗黄酮。叶粗品中黄酮含量为0.14%，相对标准偏差为0.68%，纯化后总黄酮含量为14.89%，表明该工艺重复性强、稳定可靠、精密度高。
3 内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实品质高的特点，对沙棘产业发展非常有利[8]。沙棘作为防护林发挥着巨大的作用，其种植面积逐年增加。研究发现，沙棘中的总黄酮含量为叶籽(876毫克/100克)、果渣(502毫克/100克)、鲜果汁(365毫克/100克)和鲜浆果(354毫克/100克)，表明从叶提取黄酮具有重要意义[9]。目前，从对沙棘中提取总黄酮的方法有超临界CO2流体萃取法、微波萃取法、超声波萃取法、有机溶剂萃取法、水提取法等。超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离。微波提取和超声波提取仅限于少量的提取实验，不适合工业化生产。水浸法提取沙棘总黄酮率低；甲醇和丙酮在有机溶剂提取中含有有毒成分，因此乙醇提取黄酮沙棘是一种适合工业化生产的方法[10]。通过实验对该方法进行了优化，以60%乙醇为提取溶剂，提取时间为30分钟，不仅节省时间，而且可以重复使用，无毒性和残留，适合工业化生产。叶黄酮收率为8.71%，对相高。然而，黄酮的含量(0.14%)低于在吕敏通过正交试验从山西提取的沙棘[11]，而总黄酮的含量在叶(4.82%)，这可能与不同品种沙棘中黄酮的含量不同有关。王亚辉等。[12]黄酮同一沙棘在内蒙古，对不同产地的含量发现：和林格尔， 内蒙古县(2.50.07)% 内蒙古凉城县(2.30.02)% 内蒙古东胜区(2.20.08)% 内蒙古翁牛特旗(1.80.01)% 内蒙古http://10037。除集宁，外，五个产地的黄酮总含量均达到《中国药典》标准(1.5%)。本试验选用的沙棘品种恰好来自集宁区， 卓资山县，提取的原料不是在含量最高的季节5月份采收，而是在产量较高的7月份采收。原料只提取了一次，而吕敏的原料提取了三次，因此实验中的黄酮含量低于对。与其他研究结果[13-15]相比，产品收率较高，提取工艺简单，乙醇无残留，可重复使用，适用于沙棘总黄酮的提取，可大规模生产。
黑曼巴 