基因组DNA的提取(动物皮张基因组DNA三种提取方法比较)

脱氧核糖核酸是分子生物学研究的基础。随着生物学研究特别是遗传学研究的深入，对动物的物种鉴定、物种起源和多样性评价以及亲缘关系研究已经在分子水平上得到广泛应用。从动物皮肤标本中提取脱氧核糖核酸的研究始于20世纪80年代。虽然有许多成功提取的报道，但是提取的基因组DNA含量低且片段短，并且难以进行聚合酶链反应扩增。虽然提取方法不断改进，但获得的脱氧核糖核酸质量仍然不是很高。

目前，皮肤来源的鉴定方法比较落后，国内外还没有统一的技术标准和成熟的鉴定方法。传统的宏观观察方法和微观观察方法主观性强，不能准确、快速地区分皮肤来源。随着分子生物学技术的发展，基于DNA的生物鉴定方法逐渐丰富。DNA分子鉴定方法主要是利用生物物种表现出的不同DNA序列信息来鉴定来源，可以突破基于动物纤维结构和形态进行鉴定的局限，比传统的分析方法更加客观和准确。因此，获得高质量的动物皮肤基因组已经成为鉴定皮肤来源的迫切要求。

本实验以SDS法为基础，结合蛋白酶k、Chelex -100和Glass Milk DNA提取技术，并与前人发表的旧的皮肤DNA提取方法和DNA提取试剂盒方法进行比较，旨在开发一种操作简单、DNA提取效率高、成本低的优化方法，为后续的分子生物学实验提供必要的条件。

1材料和方法

1.1测试材料

9个干驴皮样品，编号分别为1 ~ 9。每个样本平均分为三个部分，分别用于方法甲、方法乙和方法丙。材料由山东省论文农业科学院生物技术研究中心测序中心提供

1.2测试试剂

(1)消化缓冲液A(10摩尔/升三盐酸，25摩尔/升乙二胺四乙酸，100摩尔/升氯化钠，0.5%十二烷基硫酸钠，pH8.0)，Chelex-100，20毫克/毫升蛋白酶k，氯仿，玻璃牛奶，脱氧核糖核酸结合缓冲液，70%乙醇，无水乙醇和te

(2)消化缓冲液B(10摩尔/升三盐酸，0.5%十二烷基硫酸钠，1摩尔/升氯化钙，0.2毫克/毫升蛋白酶K，pH 8.0)，1摩尔/升乙二胺四乙酸，10%螯合水溶液，苯酚，氯仿，异戊醇，3摩尔/升萘乙酸，无水乙醇，75

(3)脱氧核糖核酸提取试剂盒。

(4) HiFi缓冲液：反式Taq DNA聚合酶高保真度购自北京全式金生物技术有限公司.

1.3测试方法

1.3.1基因组脱氧核糖核酸提取方法甲：取约30毫克驴皮样品，研磨成颗粒，放入2毫升A1-A9号电生理管中，用1毫升加；去离子水洗涤两次，向加，加入400微升消化缓冲液甲、380微升L5% Chel-ex-100和20微升20毫克/毫升蛋白酶K，水浴温度保持在50 ~ 600，搅拌混合均匀至全部溶解；取出，冷却至室温，摇匀5 ~ 10秒，在100的沸水中浸泡8分钟；然后，取出样品，以10000转/分钟离心1分钟，将上清液转移到新的电生理管(记录上清液的体积)，加与等体积的氯仿，混合均匀，以12000转/分钟离心5分钟，并重复该步骤两次；在收集的溶液中加入5微升玻璃牛奶至加，将其与600微升脱氧核糖核酸结合缓冲液混合，并在65水浴15分钟；室温静置5min后，以8000转/分钟离心1min，弃去上清液；加用500微升70%乙醇洗涤，以8000转/分钟的速度离心1分钟，并重复该步骤两次。向加，吹风悬浮液中加入500L无水乙醇，以8000转/分钟离心1分钟，弃去上清液；以8000转/分钟离心30秒钟，用10微升枪头吸取剩余液体，室温下干燥10分钟；将50L TE缓冲液(pH 7.0)加入到70的加，水浴中5min，快速离心，转移到新的离心管中，并在-200保存。

方法b指的是从旧皮肤中提取DNA的新方法[12]。

方法c指的是脱氧核糖核酸提取试剂盒。

1.3.2基因组DNA检测(1)紫外分光光度仪检测：取每个DNA样品2L，测量其浓度A260和A280。对每个样品进行三次生物复制，取平均值。

(2)琼脂肪糖凝胶的电泳检测：制备2.0% 琼脂肪糖凝胶，取10L 110L加载缓冲液，加入2L基因组DNA样品到加，混合均匀后，加进入点样孔，加进入DNA标记，180V 电泳，10分钟。电泳完成后，使用凝胶成像仪拍摄并保存图像，根据条带亮度、均匀度和位置粗略估计样品的纯度和碎片大小。

(3)聚合酶链反应扩增检测：根据驴线粒体基因组细胞色素b特异性序列(16S rRNA)，用PrimerPremier 5.0设计聚合酶链反应引物，上游引物mtuf:5’-atagacgagagacctatcagc-3’，下游引物mtur:5-accaiittgittcgggtcac-3’，目标片段扩增250 bp。用三种方法提取的27个基因组脱氧核糖核酸在扩增前稀释至100纳克/毫升。聚合酶链反应总体积为25L，包括ExTaq聚合酶0.2L、HiFi缓冲液2.5L、dNTP 2.0L、上游引物1.0L、下游引物1.0L、模板2.0L和ddh20 16.3 l。

2结果和分析

2.1用紫外分光光度仪检测三种方法提取的基因组DNA

从表1可以看出，甲、乙、丙获得的DNA质量在A260和A280值上有明显差异。B法的A260值达到100以上，A280值达到50以上；虽然方法C中A260和A280的值略低于方法B中的值，但总的来说仍然较高。原因可能是乙法和丙法提取的脱氧核糖核酸纯度不高，而且含有许多杂质，如苯酚、盐酸胍和聚乙二醇。过量的杂质污染导致样品浓度高，两种方法测得的DNA浓度均大于500微克/微升，远远高于方法A.方法甲提取的脱氧核糖核酸浓度为74.8-177.5纳克/微升，A260/A280约为2.0。虽然有些核糖核酸仍被污染，但脱氧核糖核酸的纯度比对氏B法和C法好。

2.2 琼脂质体凝胶电泳分析三种方法提取的基因组DNA

从琼脂肪糖凝胶电泳图可以看出，三种方法都可以从驴皮中提取基因组DNA，但获得的DNA量有显著差异。其中，方法A的基因组DNA在琼脂肪-糖凝胶电泳图谱中条带最弱，被拖带，提取量最少(图1)；方法b提取的基因组DNA比方法a多一点，但DNA降解更严重，杂质多，不够纯净(图2)；与方法A和方法B相比，方法C提取基因组DNA的定量相对最大，带最亮，提取效果最好，但存在降解现象和RNA等杂质(图3)。

2.3三种方法提取的基因组DNA的聚合酶链反应扩增检测

以三种方法提取的基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增目标片段。从图4-6可以看出，所有三种方法都能很好地扩增目标片段，条带清晰、整齐，这表明所有三种方法都能从干燥的驴皮中提取出质量更好的基因组DNA，并可应用于后续的分子生物学实验。

3结论和讨论

玻璃牛奶是一种以二氧化硅为悬浮物的特制水溶液，具有快速、定量、特异地结合脱氧核糖核酸的能力，可替代苯酚、氯仿等有毒有机物分离纯化脱氧核糖核酸。在高盐溶液中，核酸是不溶的，可以吸附在玻璃基底上，而蛋白质在高盐溶液中是高度可溶的，脂类物质悬浮在溶液表面，从而起到纯化和分离DNA的作用。恩格尔斯坦等人首次报道了用二氧化硅纯化脱氧核糖核酸，他们用这种方法纯化测序级模板脱氧核糖核酸。该方法不仅消除了苯酚、氯仿，等对对，有毒的药物的使用，而且达到了高效、快速、批量提取DNA的目的，具有经济、实用、高效、无毒的特点。本研究采用SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法从动物皮肤中提取微量DNA，获得高浓度的DNA。此外，玻璃牛奶脱氧核糖核酸纯化技术可以显著去除残留蛋白质和金属离子，并显著提高脱氧核糖核酸的纯度。

本研究采用紫外分光光度仪、琼脂肪糖凝胶电泳和聚合酶链反应扩增技术，分别对Chelex-100结合玻璃牛奶提取的全基因组DNA和以往报道的方法及试剂盒方法提取的基因组DNA进行了评价。综合分析表明，方法A提取的基因组DNA虽然量少，但纯度高，电泳能显示条带，能很好地扩增目标片段，满足分子生物学实验的要求。此外，所用试剂和仪器成本低，操作简单，耗时14小时，相对法时间短。方法b获得的基因组DNA浓度高，也可用于靶带的聚合酶链反应扩增。虽然操作和仪器试剂与方法a相似，但基因组DNA的电泳谱带和吸光度值显示存在蛋白质、RNA等杂质污染，电泳谱带不太整齐，耗时20小时，耗时较长对。方法c提取的基因组DNA具有中等浓度和清晰整洁的谱带，可用于靶片段的聚合酶链反应扩增。然而，从光吸收值来看，可能存在更多的杂质，如苯酚、聚乙二醇和盐酸胍，并且试剂盒的价格比对的更贵

综上所述，本研究中的三种方法均可用于提取干燥动物皮肤的基因组DNA。通过对比值分析，方法A，即SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法和玻璃牛奶纯化技术，具有基因组DNA纯度高、杂质少、操作简单、仪器和试剂便宜等优点。与方法B和方法C相比，它能更好地用于分子生物学实验。

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