猪繁殖与呼吸综合征病毒属于什么科(猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株的分离与鉴定)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，俗称蓝耳病，是一种急性和高度传染性的病毒性传染病，其特征是猪的繁殖障碍和呼吸系统症状。其临床特点是仔猪有不同程度的呼吸系统疾病和待产母猪的生殖障碍，如胎儿干瘪、胎儿虚弱、死产或流产，死亡率高[1]。这种疾病在20世纪80年代末和90年代初在美国被报道，然后迅速传播到世界各地的养猪国家。在生猪密集和流动频繁的地区更为普遍，往往造成严重的经济损失，严重影响养猪业的生产安全。PRRS于1987年首次在美国被发现。1991年，温斯沃特等人首次用猪肺泡巨噬细胞分离PRRS病原体。1996年，中国首次从流产胎儿中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，郭宝清等[3-6]，证实了猪繁殖与呼吸综合征在中国也存在，并迅速传播到中国各地[7-8]。为了解PRRSV在新疆，的流行情况，进一步丰富PRRSV基因组的信息数据，在对，对采自乌鲁木齐， 新疆七道湾地区的病料进行组织处理后的Marc-145细胞培养物进行了毒力试验、逆转录聚合酶链反应鉴定和测序鉴定，获得了新疆本地菌株，为进一步了解该病的流行情况和生物学特性提供了科学依据。

1材料和法广场

1.1材料

1.1.1病料的收集疑似蓝耳猪的死猪的肺、淋巴结和其他组织的病料在新疆， 乌鲁木齐市的一个养猪场无菌收集，并在-70保存以备后用。

1.1.2细胞和血清Marc-145细胞系，由动物科学院兽医研究所传染病实验室提供；胎牛血清是生工的生物产品

1.1.3胰蛋白酶和链霉素的主要试剂和试剂盒保存在实验室，DMEM培养基和三唑试剂为生工生物制品；TaKaRa一步核糖核酸聚合酶链反应试剂盒(AMV)和脱氧核糖核酸标记DL2000购自TaKaRa公司。

1.2方

1.2.1用链霉素对病料进行多次处理，将病料清洗干净，切割研磨，加入适当的DMEM培养液稀释至13，反复冷冻解冻3次，装入1.5毫升无菌离心管中，以3 000转/分钟-1离心10分钟，然后留下上清液，用0.22微米滤膜灭菌，滤液作为待分离病毒液，并保持在-70备用。

1.2.2细胞培养和Marc-145细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，立即将其放入37水浴恒温罐中，用镊子轻轻摇动冻存管2分钟，使管中的内容物完全融化，用移液管取出生物安全柜中的Marc-145细胞，将其移入离心管中，加入无FBS的DMEM至4.5毫升，以1 000转/分钟-1离心5分钟。倒出上清液，加入细胞生长液至7毫升，用吸管缓慢均匀地吹，移入培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞是否被吹散，将其放入37的CO2培养箱中，左右摇动，拧上培养瓶的盖子(不要拧紧，有一个微小的缝隙，以确保CO2可以在瓶中进入。过夜后，丢弃旧的培养基，用无胎牛血清的DMEM培养基清洗一次瓶中的细胞，然后加入7毫升生长培养基(含10%胎牛血清胎牛血清)，用酒精棉球擦拭瓶盖和培养瓶上部，放入培养箱中，传给第三代进行病毒分离。

1.2.3病毒分离：将1.2.1中处理过的病料的上清液用0.22微米进行过滤和灭菌，将1毫升过滤后的菌液接种到单层的Marc-145细胞中，在37的培养箱中吸附60 ~ 90分钟，期间每30分钟振荡一次，使病毒液与细胞层均匀接触，然后将维持液(含2%胎牛血清)加入到7毫升中，然后置于盲传3代后的细胞病变效应中

1.2.4通过电子显微镜观察病毒

1.2.5病毒TCID50滴定Marc-145细胞生长成单层，消化后转移到96孔培养板中，每个孔中的单层细胞以约80%的密度生长，用于接种病毒。步骤如下。

待测病毒液的稀释：将病毒液放入灭菌的EP管中，用维持液培养基进行10倍的递增稀释，取10-3 ~ 10-7倍的稀释液，每个稀释液有5个孔，在每个孔中加入100 L病毒液，并设置两排对照明孔(用维持液代替病毒液)。在5% CO2培养箱中37吸附1小时，然后弃去病毒液，用无血清DMEM洗涤，加入100 L维持液48小时，每天观察至第5天，用毛细管电泳记录孔数，计算毛细管电泳比值。

TCID50是由里德-明希法计算出来的

1.2.6病毒核酸提取和逆转录聚合酶链反应病毒核酸提取：取750 L病毒溶液，按照生工生物公司Trizol试剂盒的操作步骤提取病毒总核酸。