固氮菌的氮源(内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应)

除了大量的水，氮源是水稻生长中最重要的生长因子。中国是世界上大米的主要生产国和消费国之一。目前，化肥是实现单位面积高产的重要因素之一。然而，中国施用的氮肥约占世界耕地面积的7%，高达世界氮肥总量的35%。进入，用氮肥灌溉稻田后，通过氨挥发、硝化反硝化和地表流失而流失，最终导致氮素利用效率下降。氮的大量流失导致一系列环境问题：地下水污染和河流湖泊富营养化；饮用水中硝酸盐浓度高于10毫克/升将导致婴儿高铁血红蛋白血症和成人胃癌。论文联盟的www.LWlm.CoM N2O和NO排放可能导致全球变暖[2]。生物固氮不仅可以为植物提供氮源，缓解化肥施用带来的一系列危害，而且具有环保、高效、节能、高效的优点。因此，研究生物固氮为水稻提供氮源具有重要意义。

植物内生菌是指在健康植物生命历史的某个或所有阶段，生活在各种组织和器官中的微生物。受感染的宿主植物不会表现出外部症状，它们的内生性可以通过组织学方法或从严格表面灭菌的植物组织中分离微生物DNA或从植物组织中直接扩增微生物DNA的方法来证明[3]。对内生真菌宿主植物的促生作用包括固氮、解磷、分泌植物激素、促进矿质元素吸收、生物控制等[4]。内生固氮菌是一种能够定殖健康植物并将固氮作用与宿主植物相结合的微生物。内生固氮细菌不仅在作物中具有固氮活性，还能分泌多种植物激素等生物活性物质，促进作物生长。因此，利用对植物内生固氮菌的促生作用，可能开辟一条不同于根瘤菌与豆科作物相互作用的途径。鉴于稗草中可能存在一些内源固氮菌，与水稻的生长环境相似，经常与水稻争夺营养，以稗草为材料分离内源固氮菌，研究了一种内源固氮菌在对水稻中的侵染和定植规律以及水稻的促生作用。

1材料和方法

1.1材料

内生固氮菌来源：Haum10是华中农业大学微生物学国家重点实验室从华中农业大学实验基地稻田沟中的稗草中分离得到的。Haum10为短杆状，不形成孢子，具有运动性，革兰氏阴性。生长在营养琼脂平板上，单个菌落光滑，菌落淡黄色，半透明，中间凸起，附着在培养基上；在无氮阿须贝氏培养基平板上，菌落透明而厚，边缘不规则并向四周扩展。根据haum10的生理生化特性和16s rdna序列的对，haum10被鉴定为泛菌属。

含绿色荧光蛋白基因的供体细菌：大肠杆菌ccll8/pfaj1820，卡那霉抗性[5]。由比利时鲁汶大学的范德利登教授主讲

E.大肠杆菌(PPK 2073，SPE r)，一种用于三亲杂交的辅助细菌。

1.2方法

1.2.1固氮酶nifh基因的扩增和固氮酶活性的测定。首先，用碱变性法提取HAUM10的总DNA，稀释100倍作为模板。固氮酶nifh基因的扩增引物和反应程序参照ueda等人的方法[7]。琼脂糖凝胶电泳后用脱氧核糖核酸纯化试剂盒回收聚合酶链反应产物。将回收的产物连接到pmd18-t载体上，并将转化加入dh5中，并选择阳性克隆进行测序。

乙炔降低了法测纯培养的内生固氮菌产生的固氮酶活性[6]。将3毫升改良的多氏培养基[8]包装在聚碳酸酯瓶中并灭菌，然后制成斜面。将等量的内生固氮菌接种于氏培养基DO，在28下培养48 h，然后用不透气的胶塞代替PA瓶上的硅胶盖。用注射器平衡瓶内外压力后，抽出10%体积的空气，注入等体积的乙炔，在28下继续培养24小时。气相色谱法测定乙烯产量。

1.2.2吲哚乙酸生产试验用CCM培养基[9]:葡萄糖5g、甘露糖5g、苹果酸5g、氯化铵1g、去离子水1000ml、ph 5.8、色氨酸0.2g/L.将细菌接种于CCM培养基中，培养1周；离心10 000克15分钟，收集上清液；用盐酸将上清液的ph值调节至2.8；用等体积的乙酸乙酯提取3次；提取物在40水浴中蒸发，真空浓缩至近干，然后用1毫升无水乙醇悬浮。高效液相色谱检测：采用C18色谱柱，流动相为甲醇醋酸水=30 1 70，流速为1.2毫升/分钟， IAA=280纳米[10]。